瀚海新酶

mRNA疫苗及药物概念验证服务

- mRNA Vaccine and Drug Proof-of-Concept Services -

mRNA疫苗及药物

mRNA疫苗打破了传统灭活、减毒疫苗的免疫激活模式，创新性地利用人体本身细胞生产抗原，以此激活特异免疫，在新冠疫情期间大放异彩。mRNA疫苗及药物的应用前景非常广阔，除了能够用于预防传染性疾病，治疗肿瘤和免疫疾病，还可应用于多种生物药平台技术中，例如：蛋白补充治疗，细胞疗法，抗体类药物，基因编辑等等。在后新冠疫情时代，mRNA疫苗仍旧具备大幅增长的潜力。

mRNA免疫抗原抗体制备

mRNA具有编码几乎所有蛋白质的潜力。mRNA疫苗技术可以借鉴到抗原制备中, 用来解决蛋白制备困难的问题：如传统蛋白类抗原制备周期长、生产工艺复杂，生产定制的灵活性较差等。mRNA作为一种平台化技术，有着生产工艺简单，生产周期短，灵活性高等优点，可以更快更节约成本地为客户提供抗原的制备，进行快速的靶点可行性验证。

生产周期

生产工艺

表达系统

生产定制化的灵活性

配套的基础设施

感染性风险

生产的难易程度

生产成本

蛋白抗原

mRNA抗原

长

短

复杂，不同蛋白间工艺可参考性低

较简单，不同mRNA序列间工艺参考性高

根据需求需要多种表达系统，后续工艺复杂

表达系统简单，具有完整的翻译后修饰功能和最完美的生理环境

基于工艺复杂度，灵活性差

基于不同序列工艺参考性高，灵活性很高

设施多且复杂

少且简单

表达宿主存在感染性风险

无感染性风险

困难，生产工艺复杂

容易，可以平台化生产

高

低

瀚海新酶提供一站式mRNA疫苗&药物开发概念验证服务，助力客户快速验证药物靶点可行性

- 经验丰富的团队，已成功交付多个概念验证项目

- 多样化的工具，利用alphafold预测蛋白的二级结构，为客户的抗原设计和mRNA序列设计提供指导。

- 自主建立的mRNA技术与应用平台，完善的质量体系，从序列设计、mRNA-LNP制备到体内生物学评估的全流程服务。

01

提交需求

02

销售确认

03

序列设计

04

基因合成和质粒扩增

05

IVT合成mRNA

06

细胞翻译水平检测

07

08

LNP包封

动物体内验证

交付标准

- DELIVERY STANDARDS -

服务类别	用时（工作日）	交付
序列设计	5	10条候选序列
质粒构建扩增	30	质粒及序列文件，提供合成的原始质粒（1-2μg ）
mRNA原液合成	5	mRNA原液检测报告
mRNA细胞翻译水平检测	10	翻译水平检测报告
LNP包封	10	1mg LNP
体内翻译水平检测（可选）	20	检测报告
体内细胞免疫检测（可选）	10	检测报告
体液免疫检测（可选）	20	检测报告
体内翻译水平+体液免疫检测（可选）	20	检测报告
体内翻译水平+体液免疫检测+细胞免疫检测（可选）	20	检测报告

过往案例

- CASE -

mRNA疫苗设计

第一步

序列设计

第二步

质粒制备

第三步

体外转录合成mRNA

第四步

翻译水平检测

第五步

LNP包封

step1：确认氨基酸序列

基于AI智能工具--Alphafold蛋白结构预测分析工具，与上海交通大学微生物国家重点实验室合作，建设了蛋白结构预测及优化体系。

step2：解码DNA核苷酸序列

瀚海新酶基于多种序列优化工具，输出核苷酸序列文件，为下一步优化提供支撑。

01

· 靶点确定：确定药物开发的靶点。

02

· 优化设计：依据MFE和CAI多参数组合，输出多条候选序列，并对其排序。

03

· 筛选方案：依据所选序列的MFE和CAI，以尽可能全面覆盖所有序列集合为标准，进行候选序列的选择并用于湿实验。

04

· 实验验证：通过湿实验验证，筛选出最佳的序列。

05

· 最优序列的交付：交付给客户的将是经过严格筛选，最有可能成为最优药物候选物的序列。

step3：mRNA序列优化

①Kozak序列显著增加蛋白表达

②UTR适配性影响CDS序列表达效果

— kozaK

+ kozaK

③转录起始序列

	T7启动子+转录起始序列	IVT产量
saRNA-EGFP（AU,UTP）	TAATACGACTCACTATAATG GGCGGCGCAT	正常，1：181
	TAATACGACTCACTATAATG CGGCGCAT	无产量
	TAATACGACTCACTATAAT CGGCGCAT	无产量

④mRNA的A尾序列验证。

step4：软件预测候选序列的二级结构

预测候选序列的二级结构，避免出现5‘高级结构稳定或超稳互补结构的序列。

EGFP mRNA
MFE：-314.62

saRNA-EGFP
MFE -2718.90

第一步：序列设计

第二步：质粒制备

1、菌种筛选——控制产量及超螺旋比例

单克隆

感受态

2、发酵工艺——控制OD600及质粒产量

针对不同感受态、不同质粒优化各项参数：

· 培养基配方 · 发酵罐参数 · 补料配方及补料策略 · 发酵罐控制参数

3、质粒优化重要指标——PolyA尾稳定性

不同感受态转化质粒，挑选A尾稳定的单克隆

不同质粒骨架发酵放大后，测序质检PolyA尾的杂合度不同

通过感受态/单克隆/质粒骨架的筛和发酵工艺的优化，最终获得高超螺旋比例，PolyA尾稳定的质粒

4、纯化工艺

（1）裂解工艺优化

（2）分子筛层析，去除RNA

（3）亲和层析，去除开环质粒

（4）离子交换层析，去除内毒素

5、产品放行检测

质控项	编号	检测项目	检测方法
细菌种子库检验	1	细菌形态	显微观察
	2	质粒限制性酶切图谱	限制性内切酶切
	3	目的基因测序	测序
	4	其他元件测序	测序
	5	细菌鉴别	培养法/细菌染色/生化反应
	6	抗生素抗性	培养法
菌种传代稳定性	1	质粒序列大小	电泳/测序
	2	质粒序列准确性	测序
	3	质粒限制性酶切图谱	限制性内切酶切
	4	质粒拷贝数	ddPCR
	5	传代代次限制	培养法
超螺旋质粒质控	1	外观	目测法
	2	PH值	PH计
	3	纯度（A260/A280）	紫外分光光度计
	4	限制性内切酶鉴定	琼脂糖凝胶
	5	测序鉴定	测序
	6	浓度	分光光度法
	7	DNA同质性	电泳法或HPLC
	8	宿主蛋白DNA残留	Elisa
	9	RNA残留	电泳法
	10	宿主DNA残留	QPCR
	11	微生物限度/无菌	薄膜过滤法
	12	内毒素	鲎试剂

WT-T7 （客户体系）

产量：191.9μg/20μL反应

完整度：75.6%

替换M6/酶用量优化

产量：176.8μg/20μL反应

完整度：83.0%

数据库分析及Buffer优化

产量：240.1μg/20μL反应

完整度：84.7%

使用增强剂（终IVT体系）

产量：203.8μg/20μL反应

完整度：88.2%

最终优化后，达到客户预期

第三步：体外转录

第四步：翻译水平检测

验证水平	检测方法	周期	结果展示
细胞内表达水平验证	荧光显微检测	3天
	流式分析	3天
	萤火虫萤光素酶的检测	3天
	免疫荧光IF	3天
	WB	3天
	ELISA	3天
体内表达水平验证	体内活体成像	1~2天
体内表达水平验证	血清蛋白表达检测	2天

第五步： LNP包封

LNP微流控制备工艺

Prepare ethanolic lipid mixture with cationic lipid,phospholipid, sterol lipid,and PEGylated lipid

Prepare aqueous oligonucleotide solution

Mix using a range of specialized-to-basic equipment methods

Optional: Perform size extrusion

Uniformly sized lipid nanoparticles

瀚海新酶针对 LNP 的下游纯化工艺进行了探索和优化，主要针对进口流速、跨膜压差 TMP（Trans-Membrane Pressure Drop）、膜孔径、膜面积、膜材质、中空纤维和平板膜包进行开发，工艺时间可控制在 3.5h 左右，mRNA-LNP 制剂的-80℃ 的稳定性可达 18 个月以上，可冻融 10 次不影响理化指标。